ዜና

የፖሊሜሬዝ ሰንሰለት ምላሽ (PCR)

AP.BIO፡

IST-1 (አህ)

,

IST‑1.P (LO)

,

IST‑1.P.1 (EK)

አንድ የተወሰነ የዲኤንኤ ዒላማ ክልል ለማጉላት ወይም ብዙ ቅጂዎችን ለመሥራት የሚያገለግል ዘዴ።

 

ዋና ዋና ነጥቦች:

  • የ polymerase ሰንሰለት ምላሽ, ወይም PCR፣ የአንድ የተወሰነ የዲኤንኤ ክልል ብዙ ቅጂዎችን የማድረግ ዘዴ ነው። በብልቃጥ ውስጥ (ከኦርጋኒክ ይልቅ በሙከራ ቱቦ ውስጥ).
  • PCR በቴርሞስታብል ዲ ኤን ኤ ፖሊሜሬዝ ላይ የተመሰረተ ነው፣ ታቅ polymerase, እና ዲ ኤን ኤ ያስፈልገዋል ፕሪመርስ በተለይ ለዲኤንኤ ክልል ፍላጎት የተነደፈ.
  • በ PCR ውስጥ, ምላሹ በተከታታይ የሙቀት ለውጦች አማካኝነት በተደጋጋሚ ሳይክል ይሽከረከራል, ይህም የታለመው ክልል ብዙ ቅጂዎች እንዲፈጠሩ ያስችላቸዋል.
  • PCR ብዙ ምርምር እና ተግባራዊ መተግበሪያዎች አሉት። እሱ በመደበኛነት በዲ ኤን ኤ ክሎኒንግ ፣ በሕክምና ምርመራዎች እና በዲ ኤን ኤ ላይ የፎረንሲክ ትንተና ጥቅም ላይ ይውላል።

PCR ምንድን ነው?

የ polymerase ሰንሰለት ምላሽ (PCR) የአንድ የተወሰነ ዲኤንኤ ክልል ብዙ ቅጂዎችን (ሚሊዮን ወይም ቢሊየን!) ለመሥራት የሚያገለግል የተለመደ የላቦራቶሪ ዘዴ ነው። ይህ የዲኤንኤ ክልል ሞካሪው የሚፈልገው ማንኛውም ነገር ሊሆን ይችላል። ለምሳሌ፣ እሱ ተመራማሪው ሊገነዘበው የሚፈልገው ተግባር ወይም የወንጀል ትእይንት ዲኤንኤ ከተጠርጣሪዎች ጋር ለማዛመድ የዘረመል ምልክት ሊሆን ይችላል።

በተለምዶ፣ የ PCR አላማ የታለመውን የዲኤንኤ ክልል በበቂ ሁኔታ እንዲተነተን ወይም በሌላ መንገድ ጥቅም ላይ እንዲውል ማድረግ ነው። ለምሳሌ፣ በ PCR የተጨመረው ዲኤንኤ ሊላክ ይችላል። ቅደም ተከተል፣ የሚታየው በ ጄል ኤሌክትሮፊዮራይዝስ, ወይም ክሎድ ለተጨማሪ ሙከራዎች ወደ ፕላዝሚድ.

PCR በሞለኪውላር ባዮሎጂ ምርምር፣ በህክምና መመርመሪያ እና በአንዳንድ የስነ-ምህዳር ዘርፎችን ጨምሮ በብዙ የባዮሎጂ እና የህክምና ዘርፎች ጥቅም ላይ ይውላል።

Taq polymerase

ላይክ ያድርጉ የዲኤንኤ ማባዛት በሰውነት ውስጥ፣ PCR የዲ ኤን ኤ ፖሊመሬሴን ኢንዛይም ይፈልጋል፣ ይህም አዲስ የዲ ኤን ኤ ክሮች ይፈጥራል፣ ያሉትን ክሮች እንደ አብነት ይጠቀማል። በተለምዶ በ PCR ውስጥ ጥቅም ላይ የዋለው የዲ ኤን ኤ ፖሊመሬሴ ይባላል ታቅ polymerase, ከሙቀት መቋቋም የሚችል ባክቴሪያ ከተነጠለ በኋላ (Tሄርሙስ አ.አuaticus).

ቲ. አኳቲከስ በሙቀት ምንጮች እና በሃይድሮተርማል አየር ውስጥ ይኖራል. የእሱ የዲ ኤን ኤ ፖሊመሬዜዝ በጣም በሙቀት-የተረጋጋ ነው እና በ 70 °\text C70°C70፣°፣የመጀመሪያ ጽሑፍ፣ሲ፣የመጨረሻ ጽሑፍ (የሰው ሙቀት መጠን ወይም የሙቀት መጠን)። ኮላይ ዲ ኤን ኤ ፖሊሜሬዝ የማይሰራ ይሆናል)። ይህ የሙቀት-መረጋጋት Taq polymerase ለ PCR ተስማሚ ያደርገዋል. እንደምናየው ከፍተኛ ሙቀት በ PCR ውስጥ በተደጋጋሚ ጥቅም ላይ ይውላል denture አብነት ዲ ኤን ኤ, ወይም ክሮቹን ይለያዩ.

PCR ፕሪመር

እንደ ሌሎች የዲ ኤን ኤ ፖሊመሬሶች ታቅ ፖሊመሬሴ ዲኤንኤ ማድረግ የሚችለው ሀ ከተሰጠ ብቻ ነው። ፕሪመርለዲኤንኤ ውህደት መነሻ የሚሆን አጭር ተከታታይ ኑክሊዮታይድ። በ PCR ምላሽ፣ ሞካሪው እሷ ወይም እሱ በመረጧቸው ፕሪመርሮች የሚገለበጡ ወይም የሚጨመሩትን የዲኤንኤ ክልል ይወስናል።

PCR primers አጫጭር ነጠላ-ፈትል ዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮች ናቸው፣ አብዛኛውን ጊዜ በ202020 ኑክሊዮታይድ ርዝመት። በእያንዳንዱ PCR ምላሽ ውስጥ ሁለት ፕሪመርሮች ጥቅም ላይ ይውላሉ, እና እነሱ የተነደፉት የታለመውን ክልል (መገልበጥ ያለበት ክልል) ወደ ጎን እንዲቆሙ ነው. ማለትም፣ የሚቀዳው በክልሉ ጠርዝ ላይ ካለው አብነት ዲ ኤን ኤ ተቃራኒ ክሮች ጋር እንዲተሳሰሩ የሚያደርጋቸው ቅደም ተከተሎች ተሰጥቷቸዋል። ፕሪምሮች ከአብነት ጋር በማጣመር ተጨማሪ መሠረት ይያያዛሉ።

የአብነት ዲ ኤን ኤ፡

5′ ታታክጋቲካታግጋጂ

ዋና 1፡ 5′ CAGATCCATGG 3′ ፕሪመር 2፡

ፕሪመርዎቹ ከአብነት ጋር ሲታሰሩ በፖሊሜሬዝ ሊራዘሙ ይችላሉ, እና በመካከላቸው ያለው ክልል ይገለበጣል.

[ዲኤንኤ እና ዋና አቅጣጫን የሚያሳይ ተጨማሪ ዝርዝር ሥዕላዊ መግለጫ]

የ PCR ደረጃዎች

የ PCR ምላሽ ቁልፍ ንጥረ ነገሮች ናቸው። ታቅ polymerase, primers, አብነት ዲ ኤን ኤ እና ኑክሊዮታይድ (ዲ ኤን ኤ የግንባታ ብሎኮች). ንጥረ ነገሮቹ በቱቦ ውስጥ ይሰበሰባሉ ፣ ኢንዛይም ከሚያስፈልጉት ተጓዳኝ አካላት ጋር ፣ እና ዲ ኤን ኤ እንዲዋሃድ በሚያስችል የሙቀት እና የማቀዝቀዝ ዑደት ውስጥ ይደረጋሉ።

መሰረታዊ ደረጃዎች የሚከተሉት ናቸው:

  1. ዲናትዩሽን (96 °\text C96°C96፣°፣ጽሑፍ ጀምር፣C፣መጨረሻ ጽሑፍ)፡- የዲኤንኤ ገመዶችን ለመለየት፣ ወይም denatuture ምላሹን በብርቱ ያሞቁ። ይህ ለቀጣዩ ደረጃ ነጠላ-ክር አብነት ያቀርባል.
  2. ማቃለል (555555 - 656565°\ጽሑፍ C°C°፣ ፅሑፍ ጀምር፣ C፣ መጨረሻ ጽሑፍ)፡- ምላሹን ያቀዘቅዙ፣ በዚህም ፕሪመሮች ከተጨማሪ ተከታታዮቻቸው ጋር በአንድ ገመድ ባለው አብነት ዲኤንኤ ላይ ማያያዝ ይችላሉ።
  3. ቅጥያ (72°\ጽሑፍ C72°C72፣ °፣ ጽሑፍ ጀምር፣ C፣ መጨረሻ ጽሑፍ)፡ የምላሽ ሙቀቶችን ከፍ ያድርጉት ስለዚህ ታቅ ፖሊመሬሴ ፕሪመርስን ያሰፋዋል, አዲስ የዲ ኤን ኤ ክሮች ይፈጥራል.

ይህ ዑደት በተለመደው PCR ምላሽ 252525 - 353535 ጊዜ ይደግማል፣ ይህም በአጠቃላይ ከ222 - 444 ሰአታት ይወስዳል፣ ይህም እንደ ዲኤንኤው ክልል የሚገለበጥ ቆይታ ነው። ምላሹ ቀልጣፋ ከሆነ (በጥሩ ሁኔታ የሚሰራ)፣ የታለመው ክልል ከአንድ ወይም ከጥቂት ቅጂዎች ወደ ቢሊዮኖች ሊሄድ ይችላል።

ምክንያቱም በእያንዳንዱ ጊዜ እንደ አብነት የሚያገለግለው ዋናው ዲ ኤን ኤ ብቻ ስላልሆነ ነው። በምትኩ፣ በአንድ ዙር የተሰራው አዲሱ ዲ ኤን ኤ በሚቀጥለው ዙር የDNA ውህድ እንደ አብነት ሆኖ ሊያገለግል ይችላል። ብዙ የፕሪመርስ ቅጂዎች እና ብዙ ሞለኪውሎች አሉ ታቅ በምላሹ ውስጥ የሚንሳፈፍ ፖሊመሬሴ ፣ ስለዚህ የዲኤንኤ ሞለኪውሎች ብዛት በእያንዳንዱ ዙር ብስክሌት በግምት በእጥፍ ሊጨምር ይችላል። ይህ የአርቢ እድገት ንድፍ ከዚህ በታች ባለው ምስል ይታያል።

የ PCR ውጤቶችን በዓይነ ሕሊናህ ለማየት ጄል ኤሌክትሮፊሸሬሽን በመጠቀም

የ PCR ምላሽ ውጤቶቹ ብዙውን ጊዜ በምስል የሚታዩ (የሚታዩ) በመጠቀም ነው። ጄል ኤሌክትሮፊዮራይዝስጄል ኤሌክትሮፊዮራይዝስ የዲ ኤን ኤ ፍርስራሾች በጄል ማትሪክስ በኤሌክትሪክ ፍሰት የሚጎተቱበት እና የዲ ኤን ኤ ፍርስራሾችን በመጠን የሚለይበት ዘዴ ነው። በ PCR ናሙና ውስጥ የሚገኙትን ቁርጥራጮች መጠን ለማወቅ እንዲቻል መደበኛ ወይም የዲ ኤን ኤ መሰላል ይካተታል።

ተመሳሳይ ርዝመት ያላቸው የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮች በጄል ላይ "ባንድ" ይፈጥራሉ, ይህም ጄል በዲ ኤን ኤ ማያያዣ ቀለም ከተበከለ በአይን ሊታይ ይችላል. ለምሳሌ፣ 400400400 ቤዝ ጥንድ (ቢፒ) ቁርጥራጭ የሚያመርት PCR ምላሽ በጄል ላይ ይህን ይመስላል።

የግራ መስመር፡ የዲኤንኤ መሰላል ከ100፣ 200፣ 300፣ 400፣ 500 ቢፒ ባንድ ጋር።

የቀኝ መስመር፡ የ PCR ምላሽ ውጤት፣ ባንድ በ 400 ቢፒ.

የዲኤንኤ ባንድ አንድ ወይም ጥቂት ቅጂዎችን ብቻ ሳይሆን የታለመውን የዲኤንኤ ክልል ብዙ ብዙ ቅጂዎችን ይዟል። ዲ ኤን ኤ በአጉሊ መነጽር የሚታይ ስለሆነ በአይን ከማየታችን በፊት ብዙ ቅጂዎቹ መገኘት አለባቸው። PCR ጠቃሚ መሳሪያ የሆነው ለምንድነው ይህ ትልቅ አካል ነው፡ ያን የዲኤንኤ ክልል ለማየት ወይም ልንጠቀምበት የምንችለውን በቂ የዲኤንኤ ቅደም ተከተል ያወጣል።

የ PCR መተግበሪያዎች

PCR ን በመጠቀም የዲኤንኤ ቅደም ተከተል በሚሊዮኖች ወይም በቢሊዮኖች በሚቆጠር ጊዜ ሊጨምር ይችላል, ይህም በቂ የዲኤንኤ ቅጂዎችን በማምረት ሌሎች ቴክኒኮችን በመጠቀም ይመረመራል. ለምሳሌ፣ ዲ ኤን ኤው በጄል ኤሌክትሮፊዮርስስ ሊታይ ይችላል፣ ወደ ተላከ ቅደም ተከተል, ወይም በተከለከሉ ኢንዛይሞች እና ክሎድ ወደ ፕላዝሚድ.

PCR በብዙ የምርምር ላብራቶሪዎች ውስጥ ጥቅም ላይ ይውላል፣ እና በፎረንሲክስ፣ በዘረመል ምርመራ እና በምርመራዎች ላይ ተግባራዊ አፕሊኬሽኖችም አሉት። ለምሳሌ፣ PCR ከበሽተኞች ዲኤንኤ (ወይም ከፅንስ ዲ ኤን ኤ፣ የቅድመ ወሊድ ምርመራን በተመለከተ) ከጄኔቲክ መታወክ ጋር የተያያዙ ጂኖችን ለማጉላት ይጠቅማል። PCR በተጨማሪም በታካሚው ሰውነት ውስጥ የባክቴሪያ ወይም የዲኤንኤ ቫይረስን ለመፈተሽ ሊያገለግል ይችላል፡ በሽታ አምጪ ተህዋሲያን ከተገኘ የዲኤንኤውን ክልሎች ከደም ወይም ከቲሹ ናሙና ማጉላት ይቻል ይሆናል።

የናሙና ችግር፡ PCR በፎረንሲክስ

በፎረንሲክስ ቤተ ሙከራ ውስጥ እየሰሩ ነው እንበል። በወንጀል ቦታ ከተወው ፀጉር የዲኤንኤ ናሙና ተቀብለሃል፣ ከዲኤንኤ ናሙናዎች ከሶስት ተጠርጣሪዎች ጋር። የእርስዎ ተግባር የተለየ የዘረመል ምልክትን መመርመር እና ከሶስቱ ተጠርጣሪዎች መካከል አንዳቸውም ለዚህ ምልክት ማድረጊያ ከፀጉር ዲ ኤን ኤ ጋር ይዛመዳሉ ወይም አለመሆኑን ለማየት ነው።

ምልክት ማድረጊያው በሁለት alleles ወይም ስሪቶች ይመጣል። አንደኛው አንድ ነጠላ ድግግሞሽ (ከታች ቡናማ ክልል) ይዟል, ሌላኛው ደግሞ ሁለት ቅጂዎችን ይዟል. በፒሲአር ምላሽ ከድጋሚው ክልል ጎን ባሉት ፕሪመርሮች ፣የመጀመሪያው አሌል የ200200200 \text{bp}bpstart text፣ b, p፣ end text DNA fragment ያዘጋጃል፣ ሁለተኛው ደግሞ 300300300 \text{bp}bpstart text, b , ገጽ፣ የዲኤንኤ ቁርጥራጭ መጨረሻ ጽሑፍ፡-

ምልክት ማድረጊያ አሌል 1፡ የጠቋሚዎች መደጋገሚያ ክልል 200 ቢፒ ዲ ኤን ኤ ቁራጭን ያጎላል

ምልክት ማድረጊያ አሌል 2፡ የጠቋሚዎች መደጋገሚያ ክልል 300 ቢፒ ዲ ኤን ኤ ቁራጭ ያጎላል

ከዚህ በታች እንደሚታየው PCR በአራቱ የዲ ኤን ኤ ናሙናዎች ላይ ያከናውናሉ እና ውጤቱን በጄል ኤሌክትሮፊዮርስስ ይሳሉ።

ጄል አምስት መንገዶች አሉት

የመጀመሪያ መስመር፡ የዲኤንኤ መሰላል ከ100፣ 200፣ 300፣ 400 እና 500 ቢፒ ባንድ ጋር።

ሁለተኛ መስመር፡ ዲኤንኤ ከወንጀል ቦታ፣ 200 ቢፒ ባንድ።

ሶስተኛ መስመር፡ ተጠርጣሪ #1 ዲኤንኤ፣ 300 ቢፒ ባንድ።

አራተኛው መስመር፡ ተጠርጣሪ #2 ዲኤንኤ፣ 200 እና 300 ቢፒ ባንድ።

አምስተኛው መስመር፡ ተጠርጣሪ #3 ዲኤንኤ፣ 200 ቢፒ ባንድ።

የየትኛው ተጠርጣሪ ዲኤንኤ በዚህ ምልክት ላይ ካለው የወንጀል ቦታ ዲኤንኤ ጋር ይዛመዳል?

1 መልስ ምረጥ፡-

1 መልስ ምረጥ፡-

(ምርጫ ሀ)

A

ተጠርጣሪ 111

(ምርጫ ለ)

B

ተጠርጣሪ 222

(ምርጫ ሐ)

C

ተጠርጣሪ 333

(ምርጫ መ)

D

ከተጠርጣሪዎች ውስጥ አንዳቸውም

[ፍንጭ]

መልስህን ደረጃ መስጠት አልቻልንም። የሆነ ነገር ባዶ ትተው ወይም ልክ ያልሆነ መልስ ያስገቡ ይመስላል።

ይፈትሹ

ስለ PCR እና forensics ተጨማሪ

ከወንጀል ትዕይንት በእውነተኛ የዲኤንኤ የፎረንሲክ ሙከራዎች ውስጥ ቴክኒሻኖች ከላይ ካለው ምሳሌ ጋር ተመሳሳይ በሆነ መልኩ ትንታኔ ያደርጋሉ። ነገር ግን፣ በወንጀል ቦታው ዲኤንኤ እና በተጠርጣሪዎቹ ዲኤንኤ መካከል በርካታ የተለያዩ ምልክቶች (በምሳሌው ላይ ያለው ነጠላ ምልክት ብቻ ሳይሆን) ይነጻጸራል።

እንዲሁም፣ በተለመደው የፎረንሲክ ትንተና ጥቅም ላይ የሚውሉት ማርከሮች በሁለት የተለያዩ ቅርጾች ብቻ አይመጡም። ይልቁንም እነሱ ከፍተኛ ናቸው። ፖሊሞርፊክ (ፖሊ = ብዙ፣ ሞርፍ = ቅጽ)። ያም ማለት በጥቃቅን ርዝመታቸው የሚለያዩ ብዙ አሌሎች ውስጥ ይመጣሉ።

በፎረንሲክስ ውስጥ በብዛት ጥቅም ላይ የዋለው የጠቋሚዎች አይነት አጭር ታንደም ይደግማል (STRs), ብዙ ተደጋጋሚ ቅጂዎች ተመሳሳይ አጭር ኑክሊዮታይድ ቅደም ተከተል (በተለምዶ ከ 222 እስከ 555 ኑክሊዮታይድ ርዝመት) ያካትታል. የአንድ STR አንዱ አሌል 202020 ድግግሞሾች፣ ሌላው ደግሞ 181818፣ እና ሌላ ልክ 101010^11start superscript፣ 1፣ end superscript ሊኖረው ይችላል።

ብዙ ማርከሮችን በመመርመር፣ እያንዳንዳቸው በብዙ የአሌሌ ዓይነቶች ይመጣሉ፣ የፎረንሲክ ሳይንቲስቶች ከዲኤንኤ ናሙና ልዩ የሆነ የዘረመል “የጣት አሻራ” መገንባት ይችላሉ። 131313 ማርከርን በመጠቀም በተለመደው የSTR ትንተና፣ የውሸት አወንታዊ ዕድሎች (ሁለት ሰዎች ተመሳሳይ ዲ ኤን ኤ “የጣት አሻራ” ያላቸው) በ101010 ከ111 በታች ናቸው። o፣ n፣ መጨረሻ ጽሑፍ^11ጀማሪ ሱፐር ስክሪፕት፣ 1፣ የጨራ ሱፐር ስክሪፕት!

ምንም እንኳን የDNA ማስረጃ ወንጀለኞችን ለመፍረድ ጥቅም ላይ እንደሚውል ብንገምትም፣ በሐሰት የተከሰሱ ሰዎችን (ለብዙ ዓመታት ታስረው የነበሩትን ጨምሮ) ነፃ በማውጣት ረገድ ወሳኝ ሚና ተጫውቷል። የፎረንሲክ ትንታኔ አባትነትን ለመመስረት እና የሰውን ቅሪት ከአደጋ ቦታዎች ለመለየት ይጠቅማል።

[መግለጫ እና ማጣቀሻዎች]

ተማሪ ነህ ወይስ አስተማሪ?

የተማሪ መምህር

 


የልጥፍ ጊዜ: ጥር-08-2021